近日，西华大学食品与生物工程学院刘蕾副教授团队与中国科学院化学研究所吴海臣研究员团队合作，在国际顶级期刊《PNAS》发表题为“ In situ and real-time monitoring of intracellular activities in single live cells using a nanopore probe”的研究论文，西华大学食品与生物工程学院刘蕾副教授为共同通讯作者。

导语

单细胞分析技术已经显著提升了我们对细胞异质性和疾病机制的理解，但多数方法仍依赖取样、裂解或终产物检测，难以连续观察活细胞内分子活动的真实动态。本文提出一种纳米孔探针，将 Al₂O₃纳米吸管膜 的温和胞内提取能力与 MspA蛋白纳米孔 的单分子识别能力整合到同一装置中，实现了对单个活细胞内小分子的原位、实时、无标记、多重检测。作者进一步在缺氧缺糖诱导的海马神经元模型中，同时监测了 谷氨酸、抗坏血酸和ATP 的动态变化，从而直接追踪神经元兴奋性水肿发生过程中的分子事件。

研究背景

现有单细胞分析方法虽然能够定量检测细胞内容物，但通常需要细胞分选、裂解或离线分析，因此更适合获取离散时间点的数据，难以反映活细胞内部连续变化。荧光标记和电化学方法虽可用于动态监测，但往往受限于标记步骤、检测对象范围和多重分析能力。本文试图解决的核心问题，是能否建立一种同时具备实时性、原位性、单分子分辨率和多重检测能力的单细胞监测技术。

研究内容

团队构建了一种双层结构的纳米孔探针：外层为带 Al₂O₃纳米吸管 的提取界面，可轻柔穿透细胞膜并缩短分子扩散路径；内层为支撑脂双层的玻璃纳米孔膜，其中嵌入经过化学修饰的 MspA-Phen-Cu 蛋白纳米孔，用于识别不同小分子。实验表明，纳米吸管膜可有效实现胞内小分子的进出传输，同时保持较高细胞活性和较低膜损伤。进一步地，作者利用 Phen-Cu²⁺ 配位识别策略，使谷氨酸、抗坏血酸和ATP在纳米孔中产生可区分的电流阻断信号，并建立了相应浓度-事件频率定量关系。

在应用层面，作者将该探针用于 OGD（oxygen-glucose deprivation） 条件下的海马神经元监测。结果显示，在标准OGD模型中，胞内ATP和谷氨酸迅速下降，抗坏血酸则逐步耗竭，并伴随神经元胞体明显肿胀；加入 AP5 抑制NMDA受体后，这些变化显著减缓，而加入 NMDA 激活NMDA受体后，ATP、谷氨酸和抗坏血酸下降更快，细胞肿胀也更剧烈。由此，作者直接从单细胞实时分子层面验证了 NMDA受体介导的兴奋毒性水肿过程。

esearchers Develop Nanopore Probe for In Situ, Real-Time Monitoring of Single Live Cells

图1｜纳米孔探针的总体结构与工作原理
展示了传统长扩散路径探针与纳米吸管提取界面的差异，以及胞内分子经纳米吸管进入蛋白纳米孔后被实时检测的过程

文章亮点

1. 将胞内提取与纳米孔识别整合为单一探针
这项工作把纳米吸管膜的温和取样与蛋白纳米孔的单分子检测结合起来，形成了可直接插入活细胞并实时输出分子信号的集成平台。

2. 实现了单活细胞内多种小分子的同步监测
作者同时追踪谷氨酸、抗坏血酸和ATP三种关键分子，从而更完整地描绘神经元在缺血应激下的代谢和信号变化。

3. 直接揭示了神经元兴奋毒性水肿的动态分子过程
通过OGD和分别加入AP5或NMDA三种条件对比，文章从单细胞实时分子监测角度验证了NMDA受体在神经元水肿中的关键调控作用。

总体来看，这项工作展示了纳米孔技术真正进入活细胞原位动态分析场景的可行性。作者通过将Al₂O₃纳米吸管提取界面与功能化MspA纳米孔结合，实现了对单活细胞内多种小分子的实时、无标记监测，并在神经元缺血模型中直接观察到ATP耗竭、谷氨酸失衡和抗氧化分子耗损之间的动态关联。

研究图文

图2｜Al₂O₃纳米吸管膜的分子传输能力与生物相容性
展示了纳米吸管膜的SEM形貌、荧光分子跨膜传输结果，以及活死染色对细胞兼容性的验证

图3｜MspA-Phen-Cu纳米孔对Glu、AA和ATP的识别
展示了三种小分子的特征电流阻断事件、幅值分布，以及对应的定量检测曲线

图4｜OGD条件下神经元兴奋毒性水肿的分子机制示意
展示了正常条件与OGD条件下Na⁺/K⁺泵、VGCC、NMDAR、Glu和AA之间的调控关系，以及神经元水肿形成过程

图5｜单神经元内Glu、AA和ATP的实时动态监测
展示了正常、OGD、OGD+AP5和OGD+NMDA条件下的电流轨迹、分子浓度变化和神经元形态变化